وبلاگ تخصصی باکتری

در روده انسان و حیوانات گروه بزرگی از باسیل های گرم منفی و بدون اسپور زندگی می کنند .بعضی از انها مثل اشرشیاکولی قسمتی از فلور طبیعی روده بوده اما سالمونلا وشیگلا بیماریزا می باشند.این باکتریها هوازی – بیهوازی اختیاری بوده و بسیاری از آنها قندها را تخمیر می کنند.

در مسیرهای تخمیر دارای 2 روش متیل رد و وگس پروسکوئر هستیم

1:تست متیل رد

جهت ردیابی باکتری هایی که گلوکز را مصرف نموده و نتیجه نهایی متابولیسم آنها محصولات اسیدی فراوان از قبیل فومارات و استات می باشد که قابلیت تخمیر مخلوط اسیدی را معلوم می کند.برای انجام تست ارگانیسم را در محیط براث MR.VP یا محیط کلارک لوبوس در انکوباتور 35-37 درجه در مدت 48 ساعت انکوبه کرده وسپس معرف متیل رد  را اضافه کرده و بروز رنگ صورتی  تا قرمز نشانه مثبت بوده اما رنگ زرد منفی است. متیل رد مثبت نشانه اینست که PH محیط کمتر از 4.5 است.تمام  انتروباکتریاسه متیل رد مثبت بوده بجز دسته کلبسیلاسه(کلبسیلاو سراشیا و انتروباکتر) لازم به ذکر است که کلبسیلا اوزنه و رینواسکلروماتیس متیل رد مثبت است .

2 : تست وگس پروسکوئر

در تست وگس پروسکوئر تولید استوئین و بوتان دیول در مسیر تخمیر بوتان دیول در حضور آلفا نفتول در محیط نسبتا قلیایی با پیدایش رنگ قرمز ردیابی می شود.برای اینکار از محیط کشت 48 ساعته MR,VP حدود 6 قطره آلفا نفتول و 2 قطره پتاس به آن اضافه کرده و 15 دقیقه در انکوباتور گذاشته سپس آنرا می بینیم پیدایش رنگ قرمز نشانه استوئین بوده و در غیر اینصورت نتیجه منفی گزارش می شود. دسته کلبسیلاسه (کلبسیلا و سراشیا و انتروباکتر ) وگس پروسکوئر منفی بوده بجز کلبسیلا اوزونه و رینو اسکلروماتیس.در محیط قلیا یی استوئین به دی استیل اکسید شده و واکنش بین دی استیل  و الفا نفتول کاتالیز شده و رنگ قرمز دیده می شود.

تولید گاز

در بعضی از باکتریها دارای آنزیم فرمیک هیدروژن لیاز بوده که اسید فرمیک را به  دی اکسید کربن و هیدروژن تبدیل کرده که گاز را در لوله TSI میبینیم.

 

 

TSI

       از این محیط به منظور بررسی تخمیر قندها و ایجاد هیدروژن سولفوره به عنوان قدم اول در تشخیص باسیل های گرم منفی بهره می برند . منابع این قند بصورت زیر است.

1:منبع نیتروژن که جهت تامین  اسید آمینه و پروتیین است که شامل عصاره گوشت و عصاره مخمر و پپتون و پپتوز پپتون است.

2:منبع قند که حاوی گلوکز1 گرم و لاکتوز 10 گرم و ساکارز 10 گرم است.

3:منبع آهن دارای سولفات آهن بوده که بعنوان نشانگر سولفید هیدروژن می باشد.

4: منبع گوگرد که دارای سدیم تیو سولفات است.

5: آگار

6: معرف PH به اسم فنل رد که در شرایط خنثی نارنجی و در اسیدی زرد رنگ و در قلیایی قرمز است.محیط TSI بصورت اسلانت با شرایط هوازی و قسمت بات  با شرایط بی هوازی است . در  TSI رنگ اسیدی یا زرد به اسم A و رنگ قلیایی یا قرمز به اسم K,ALK است.کشت با نیدل صورت میگیردو نتیجه را بعد از 18-24 ساعت در انکوباتور می خوانیم که حالات زیر را می بینیم.

1:KlK یا هر2 حالت قرمز است  که قند تخمیر نگشته و باکتری غیر تخمیری بوده مثل پسودوموناس که در انتروباکتریاسه وجود ندارد.

2:KlA یا قرمزبروی زرد که یعنی فقط گلوکز  را تخمیر کرده مثل شیگلا . بعد از کشت باکتری اول سراغ قند گلوکز رفته که در 8 ساعت اول محیط زرد می شود بعد از تمام شدن گلوکز باکتری سراغ مصرف پروتیین رفته که نیازمند مصرف اکسیژن است پس بیشتر در سطح صورت می گیرد و حاصل متابولیسم پروتیین عوامل قلیایی است پس باکتری ترکیب پروتیینی را در سطح محیط مصرف کرده و تولید یکسری عوامل قلیایی رنگ کرده و رنگ اسلانت به  رنگ قرمز تبدیل شده اما رنگ عمق زرد باقی می ماند.

3:AlA هر2 حالت زرد است،که میتواند گلوکز  ولاکتوز و ساکارز را تخمیر کند چون غلظت لاکتوز  و ساکارز 10 برابر غلظت گلوکز است پس مقدار اسید تولیدی در اثر هر2 قند بقدری  زیاد است که محیط را اسیدی کرده که وقتی در محیط اسیدی از پروتیین استفاده کرده و عوامل قلیایی ساخته شده این عوامل قلیایی قادر نیستند بر PH اسیدی غلبه کنند و رنگ  محیط زرد می ماند.شامل باکتریهای اشرشیا و کلبسیلا و انتروباکتر و پروتئوس ولگاریس و سراشیا مارسننس و سیترو باکتر فروندی و دیورسوس می باشد.

تولید رنگ سیاه

جهت تولید سولفید هیدروژن 3 چیز لازم است وجود منبع گوگرد یا سدیم تیوسولفات و معرف سولفید هیدروژن یا سولفات آهن و باکتری که قادر به تولید سولفید هیدروژن باشد.

که باکتری ابتدا گوگرد را از منبع گوگرد جدا کرده و انرا با هیدروژن ترکیب کرده و تولید سولفید هیدروژن می کند .پس باید قبلا محیط اسیدی شده باشد یعنی زرد باشد. سولفید هیدروژن بی رنگ بوده که سولفات آهن ترکیب شده و یک کمپلکس سیاه رنگ تولید می کند.بعضی از باکتریها مثل یرسینیا انتروکولیتیکا فقط ساکارز را تخمیر کرده که در KIA می توان تشخیص داد که کدام قند را تخمیر کرده که KIA مثل TSI  است اما ساکارز ندارد.

SIM

یک محیط نیمه جامد بوده که دارای 3 قسمت است .

1:تولید سولفید هیدروژن و رنگ سیاه.

2: تست اندول که باکتری توسط آنزیم تریپتوفاناز، تریپتوفان را به اندول و پیروات و نیترات تبدیل می کند. با نیدل باکتری را در محیط که کلا بات است تلقیح کرده که بعد از 24 ساعت  نتیجه را می بینیم ابتدا حرکت را بررسی کرده که اگر محیط کدر یا رشد منتشر بود نتیجه مثبت است سپس اگر محیط سیاه بود سولفید هیدروژن مثبت می باشد سپس روی محیط معرف کواکس 2-3 قطره ریخته که به اسم پارا دی متیل آمینوبنزالدهیید بوده که با اندول واکنش داده و تولید حلقه قرمز صورتی کرده .گاهی کل محیط سیاه شده که نشانه حرکت مثبت نیز است.شیگلاو کلبسیلا بی حرکت و سولفید هیدروژن منفی هستند.

 

تست اوره

نشان که باکتری اوره آز دارد  یا نه که اوره را تجزیه می کند در پروتئوس و کمی شیگلا مثبت است.و آنرا به دی اکسید کربن,آمونیاک تبدیل می کند که آمونیاک قلیایی است  و دارای معرف فنل رد بوده که در PH قلیایی قرمز یا صورتی استاما رنگ اولیه محیط زرد است.2 نوع محیط اوره است .

1: محیط مایع استوارت

2: محیط جامد کریستین .که بهتر جواب می دهد که روی سطح کشت می دهیم .

روش کار:باکتری هایی که قادر به تولید اوره آز هستند باعث لیز اوره و ایجاد آمونیاک و دی اکسید کربن می شوند که در نتیجه تولید آمونیاک در حضور معرف PH رنگ محیط از زرد به قرمز تبدیل می شود.که در محیط کریستین اوره آگار در سطح شیبدار محیط باکتری را تلقیح کرده و در 35 درجه در 24 ساعت بررسی می کنیم که واکنش مثبت با ایجاد رنگ قرمز می باشد.

 

مصرف سیترات

  در محیط سیمون سیترات انجام می گیرد رنگ محیط  سبز می باشد که  در صورت مثبت بودن رنگ آن آبی می شود . محیط اسلانت بوده که روی آن کشت داده و تنها منبع کربن آن سیترات می باشدکه حاصل متابولیسم سیترات عوامل قلیایی است و معرف  PH به اسم بروموتیمول بلو بوده که در رنگ خنثی سبز است و در حالت قلیایی آبی و در حالت اسیدی زرد است.

گاهی باکتری سیترات منفی زده و تست مثبت شده که در اثر برداشت مقدار زیاد برداشتن کلنی است که از لاشه های دیگر باکتریها مصرف کرده و عوامل قلیایی تولید می کند که به اشتباه فکر می کنیم سیترات مثبت است به این حالت heavey inocolum  یا تلیقح زیاد گویند.

محیط مک کانکی

یک محیط صورتی با معرف نوترال رد همراه لاکتوز می باشد.که در آن عدم رشد گرم مثبت ها و فقط گرم منفی در آن رشد می کنند و از گرم منفی که رشد نمی کنند بوردتلا پروتوسیس و بروسلا و فرانسیسلا و نیسریا و پاستورلاو پسودوموناس می باشد.این محیط انتخابی در افتراق لاکتوز مثبتها از لاکتوز منفی می باشد ،که لاکتوز مثبت بصورت کلنی صورتی و لاکتوز منفی کلنی بی رنگ یا کرمی است.

وقتی اسید حاصل از تخمیر لاکتوز با نوترال رد کلنی را صورتی می کند که حتی رنگ محیط هم صورتی می شود.این محیط حاوی نمکهای صفراوی وکریستال ویوله جهت مهار رشد گرم مثبتها و قارچها می باشد.

EMB

 

که در آن گرم مثبت ها رشد نمی کنند فقط گرم منفی ها  ومخصوصا انتروباکتریاسه رشد می کنند که گرم مثبت بخاطر ائوزین متیلن بلو رشد نمی کند. که در آن لاکتوز مثبتها بنفش تیره و لاکتوز منفی صورتی کم رنگ است.گاهی شاهد پدیده Metalic Sheen یا سبز براق هستیم که در اشرشیا دیده می شود.بدلیل تخمیر شدید اسید و کاهش PH به کمتر از 6/4 میرسد .سبز فلزی در اشرشیاو کلبسیلا و انتروباکتر دیده می شودو حتی در پروتئوس نیز دیده می شود.

تست ONPG  (بتا دی گالاکتوزیداز)

بعضی از باسیل های گرم منفی قادر به تخمیر لاکتوز بوده و در تشخیص آنتروباکتریاسه از این موضوع استفاده می شود.اما برخی از باسیلهای گرم منفی لاکتوز را به آهستگی تخمیر کرده و یا اصلا تخمیر نمی کنند و این باعث اشتباه در تشخیص پاتوژن های روده ایی مثل سالمونلا می گردد.هر باکتری جهت تخمیر لاکتوز نیازمند 2 آنزیم بتا گالاکتوزیداز و پرمه آز دارد.بتاگالاکتوزیداز سبب لیز لاکتوز به گلوکز و لاکتوز می شود و پرمه آز به لاکتوز اجازه دخول به باکتری را می دهد.اگر پرمه آز نباشد باکتری با وجود داشتن بتا گالاکتوزیداز قادر به تخمیر قند نیست و اگر این باکتریها را در محیط کشت حاوی لاکتوز قرار دهند به علت نداشتن پرمه آز لاکتوز را به صورت تاخیری مصرف می کنند، که در اشرشیا و سالمونلا ،سیتروباکتر،کلبسیلا،انتروباکتر،هافنیا،سراتیا مثبت می باشد.

روش کار: یک دیسک ONPG را در آب مقطر گذاشته و از باکتری مورد نظر شیرابه تهیه کرده در محلول دیسک و لوله را در 35 درجه بمدت 6 ساعت می گذارند.اگر باکتری دارای بتا گالاکتوزیداز باشد باعث تجزیه ONPG شده و اورتونیتروفنل آزاد می گرددو محیط را به رنگ زرد در می آورد.

تست سدیم مالونات و سدیم استات

استفاده از مالونات سدیم به عنوان منبع کربن در تشخیص مهم می باشد.آن دسته از باکتریها که قادر به مصرف مالونات هستند واکنش قلیایی ایجاد کرده که بدلیل تولید انیدریک کربنیک از مالونات باشد که با آب و یون سدیم  باقی مانده از مالونات ترکیب و کربنات سدیم ایجاد کرده که معرف آبی بروموتیمول موجود در محیط را از رنگ سبز به آبی تغییر می دهد.که در کلبسیلا  مثبت بوده و همچنین در تفریق سالمونلا از آریزونا بکار می رود. محیط سدیم استات نیز مثل سدیم مالونات بوده و از معرف بروموتیمول بلو استفاده می کنند که محیط سبز می باشد در تفریق اشرشیا مثبت از شیگلا منفی می باشد.

آزمایش استات

جهت این تست از محیط استات دار جامد استفاده می کنند که دارای 25% استات سدیم می باشد .رشد باکتری در سطح محیط باعث ایجاد رنگ آبی می شود که نشانه مثبت بودن تست است  .در تشخیص آن دسته ازاشرشیا  که بی حرکت و گاز منفی بوده و با شیگلا اشتباه می شدند بکار می رود.

آزمایش مالونات

باکتری را در محیط مالونات سدیم کشت می دهند و سپس محیط را در 37 در جه در 48 ساعت گذاشته که نتیجه آزمایش با تغییر رنگ معرف موجود در محیط از سبز به آبی مشخص می شود.

 

تست حل کردن ژلاتین

توانایی بعضی از باکتری ها در ذوب ژلاتین در تشخیص مهم می باشد. ژلاتین در اثر لیز شدن به مایع تبدیل می شود.باکتریها توسط داشتن ژلاتیناز ژلاتین محیط را ذوب می کنند ،که در سراشیا و پروتئوس ولگاریس مثبت می باشد.

روش کار: برای باکتری های هوازی از محیط نوترینت ژلاتین و برای بیهوازی از تیوگلیکولات ژلاتین بهره می برند.در محیط نوترینت ژلاتین که در لوله است باکتری را کشت داده و در 37 درجه می گذاریم، بعد از 24 ساعت در یخچال بمدت 30 دقیقه می گذارند ،اگر محیط بعد از قرار گرفتن در یخچال جامد نشده باشد نشانه تجزیه شدن ژلاتین توسط باکتری می باشد.

تست آرژنین دهیدرولاز

آنزیم مسئول لیز آرژنین به اسم آرژنین دهیدرولاز نامیده می شود که از لیز آن اورنیتین و آمونیاک و انیدیدکربنیک بوجود میاید.این تست در اثر تخمیر گلوکوز سبب اسیده شدن محیط و سپس در اثر تجزیه آرژنین محیط را قلیایی می کند که نتیجه آن ایجاد رنگ بنفش می باشد.که در انترو باکتر مثبت می باشد.

تست دکربوکسیلاسیون و دزامیناسیون اسید آمینه

توانایی باکتری ها در دکربوکسیله کردن اسید آمینه یکی از روش های تشخیصی می باشد.مثلا آنزیم سبب لیز لیزین و ایجاد کاداورین می کند .و یا اورنیتین در اثر آنزیم ایجاد پوتریسین می نماید.اسیدآمینه های که بررسی می شوند شامل لیزین و اورنیتین و آرژنین و فنیل آلانین می باشند.و فنیل آلانین نیز در اثر آنزیم فنیل آلانین دامیناز تولید فنیل پیروئیک می کند که در مجاورت معرف FeCl3 10% ایجاد رنگ سبز می کند.

محیط شیگلا –سالمونلا (S-S )

محیطی هم رنگ مک کانکی بوده در تقویت رشد سالمونلا و شیگلا که در آن تخمیر قند لاکتوز مد نظر است.این محیط دارای بریلیانت گرین و املاح صفراوی در مهار رشد گرم مثبت ها و سایر اعضاء انتروباکتریاسه می باشد.معرف مورد نظر در آن نوترال رد می باشد.که لاکتوز مثبت ها دارای کلنی صورتی و لاکتوز منفی کلنی بی رنگ یا مات دارند،که سالمونلا و شیگلا دارای کلنی صورتی می باشند در این محیط تیو سولفات و آهن نیز دارد که در آن اگر باکتری H2S مثبت باشد رنگ محیط سیاه می باشد.

تست اکسیداز

باکتریها دارای یکسری سیتوکرم در غشا بوده در حمل الکترون به اکسیژن و هدف تولید انرژی می باشدباکتریهای اکسیداز مثبت دارای سیتوکرم C می باشند.توسط آنزیم سیتوکرم C اکسیداز باعث اکسیده شدن سیتوکرم C می شود.معرف لازم به اسم تترا متیل پارا فنیل دی آمین دی هیدروکلراید می باشد .

روش کار:

مقداری کلنی باکتری مورد نظر را روی کاغذ صافی گذاشته و معرف را به آن اضافه می کنیم که در صورت مثبت بودن باکتری رنگ حاصله از تست بنفش رنگ خواهد بود که در اثر ترکیب معرف با سیتوکرم C و تولید اندوفنل با رنگ بنفش می کند.که انترو باکتریاسه اکسیداز منفی می باشند.

احیاء نیترات

در انتروباکتریاسه مثبت می باشد.باکتری را در محیط نیترات براث و یا تریپتیکیس نیترات مدیوم کشت داده و آنرا در انکوباسیون به مدت 24-48 ساعت و گاهی تا 5 روز نیز باید صبر کنیم سپس با استفاده از معرف A,B نتیجه را بررسی می کنیم ابتدا معرف A یا سولفانیک اسید را در حد 3 قطره و سپس معرف B یا N,N دی متیل 1- نفتیل آمین را به مقدار 3 قطره می ریزیم و بمدت 30 دقیقه آنرا انکوبه می کنیم .اگر نیتریت NO2 باشد با معرف A تولید نمک دیازینوم تولید و دیازینوم نیز با معرف B تولید رنگ قرمز می کند.

رنگ محیط زرد بوده حالا اگر رنگ قرمز تولید نشد نمی توان آنرا منفی تلقی نمود زیرا گاهی خود نیتریت احیاء و تولید گاز NO و یا ,N2O N2 می کند.

اگر قرمز نشد مقداری پودر زینک یا روی را در لوله مایع ریخته که روی به عنوان کاتالیزور نیترات را به نیتریت تبدیل می کند، که اگر رنگ قرمز ایجاد شد

نتیجه منفی خواهد بود و اما در صورت نبودن رنگ قرمز  نتیجه مثبت می باشد یعنی نیترات در محیط تبدیل به گاز شده است . در این تست انتروباکتریاسه مثبت اما اسینتو باکتر منفی می باشند.

+ نوشته شده در  یکشنبه دهم بهمن 1389ساعت 13:24  توسط جمال فلاحی  |